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反應機制雖然過氧化氫酶完整的催化機制還沒有完全被了解，但其催化過程被認為分為兩步：其中，“Fe()-E”表示結合在酶上的血紅素基團（E）的中心鐵原子（Fe）。Fe(IV)-E(.+）為Fe(V)-E的一種共振形式，即鐵原子并沒有完全氧化到+V價，而是從血紅素上接受了一些“支持電子”。因而，反應式中的血紅素也就表示為自由基陽離子（.+).過氧化氫進入活性位點并與酶147位上的天冬酰胺殘基（Asn147）和74位上的組氨酸殘基（His74）相互作用，使得一個質子在氧原子間互相傳遞。自由的氧原子配位結合，生成水分子和Fe(IV)=O。Fe(IV)=O與第二個過氧化氫分子反應重新形成Fe(III)-E，并生成水分子和氧氣。[12]活性中心鐵原子Chemicalbook的反應活性可能由于357位上酪氨酸殘基（Tyr357）的苯酚基側鏈的存在（幫助Fe(III）氧化為Fe(IV））而得以提高。反應的效率可能是通過His74和Asn147與反應中間體作用而得以提高。[12]該反應的速率通常可以通過米氏方程來確定。過氧化氫酶也能夠氧化其他一些細胞毒性物質，如甲醛、甲酸、苯酚和乙醇。這些氧化過程需要利用過氧化氫通過以下反應來完成：同樣，具體的反應機制還不清楚。任何重金屬離子（如硫酸銅中的銅離子）可以作為過氧化氫酶的非競爭性抑制劑。另外，劇毒性的氰化物是過氧化氫酶的競爭性抑制劑，可以緊密地結合到酶中的血紅素上，阻止酶的催化反應。處于過氧化狀態的過氧化氫酶中間體的三維結構已經獲得解析，可以在蛋白質數據庫中檢索到。